康熙二十六年（1687年）十一月，孝庄突然病倒。此次病情比以往任何一次都严重，康熙皇帝万分焦急，他亲自到慈宁宫侍疾，亲尝汤药，昼夜不离地陪伴在祖母的病榻边。他还特地传谕内阁：非紧要之事，不要上奏。
康熙帝尽管召集了天下名医，他给刑部下谕：“朕侍奉太皇太后，朝夕承欢，谨遵慈训，竭诚奉养。现太皇太后身体不适，朕日夜牵挂，寝食难安，默默祈祷上天保佑，延长太皇太后的寿命。上天有好生之德，朕愿意以宽待世人来祈祷上天保佑太皇太后。所有内外问刑衙门，见监重人犯，除十恶不赦罪及贪官、光棍不赦外，其余已经奉旨监候死罪重犯，概行减免发落。
在人世的一切办法均告无效的情况下，康熙将所有的希望寄托在冥冥之上天。只要能让祖母病好，康熙愿意做一切事情。为了使太皇太后康复，康熙甘愿做违例之事。
不久，康熙向几位大学士下圣旨，称：“自太皇太后圣体违和以来，多方医治，均为奏效，病逝渐增，甚为可虑。朕夙夜忧惧，现欲亲自前往郊垣，虔诚祷告祭祀，以求上天保佑太皇太后慈躬和像，永获康宁。可将朕的意思传谕九卿。”
九卿重臣得到圣旨后，上奏到：“皇上至孝，超越万古，太皇太后违和，皇上朝夕在慈宁宫，席地奉侍，亲调药饵，寝食俱废。圣孝之诚，必当感格穹苍。臣等愚见，似不必皇上亲到天坛致祭，天心自为默佑。”
显然，众臣虽然不便违背康熙的旨意，但对皇帝亲自到天坛致祭，还是觉得不大合适。因此，他们委婉地提出了自己的意见，通过大学士转奏给康熙。
康熙决心已下，并不听从众臣的建议。再次发下谕旨要前往天坛祭祀，谕旨下发后，再无人出面阻拦。按照规矩，祭祀之前，必须有一段时间只食素食，以示对上天的尊敬。这一过程称为斋戒。礼部因此上奏：“请皇上选择斋戒、告祭日期。”
康熙马上传谕：“朕在宫中，每日都在斋戒，可于明朝步行，恭祭祈祷。”接着，康熙帝率诸王、贝勒、贝子、公及文武官员等，步行到天坛致祭。康熙帝亲自撰写了祝文：
“……值兹危殆，方寸愦迷，用敢洁蠲择日，谨率群臣，呼吁皇穹，伏恳悯念笃诚，立垂昭鉴，俾沉疴迅起，遐算长延。若大数或穷，愿减臣玄烨龄，以增太皇太后数年之寿，为此匍伏坛下，仰祈洪佑，不胜恳祷之至。”
34岁的康熙帝对上天祈祷，愿意减少自己的寿命，以延长太皇太后的在世之日。此种诚意，令在场之人无不感动。堂堂的康熙大帝，亲历过多少风云变幻，将一个诺大的帝国带向盛世。可是，在这个时候，他却是一个至情的孝子孝孙，他哭喊着，痛苦着。
饱受病痛折磨的孝庄，看到自己的孙儿如此孝顺，忍不住老泪纵横。晚景如此，即便自己受再多的苦再多的难，也值了。她拉着康熙的手，语重心长地说道：“因我老病，你日夜焦劳，竭尽心力，所有服用以及饮食之类，无所不备。我感到很满足。你如此竭诚体贴，实天下之至孝。惟愿天下后世，人人法皇帝如此大孝可也。”
此时的孝庄仍在想着国家社稷，想着康熙如此孝顺，可以作为“以孝治国”的典范，使大清王朝更加和谐稳固。可是康熙帝如此下去势必要被熬倒。诸王、贝勒、贝子、大学士、尚书、侍郎、侍卫等，一同跪在慈宁宫前，请皇上回宫，稍微休息。
康熙并不答应，说：“太皇太后病势，渐觉深笃，朕心忧虑焦灼，即便回宫，也觉不安。你们所奏，朕知道了。”他仍然守候在祖母身边，给祖母以安慰。
孝庄自知不起，告诫孙儿凡事以大清江山为重，不要为私情所感。康熙含泪点头。弥留之际，孝庄向孙儿交代了最后一件事：“太宗文皇帝梓宫，安奉已久，不可为我轻动。况我心恋汝皇父及汝，不忍远去，务于孝陵近地择吉安厝，则我心无憾矣。”
康熙二十六年（1687年）十二月二十五日子时，75岁的孝庄病逝于慈宁宫。在清廷公布的遗嘱中，孝庄简要讲述了自己再努尔哈赤、皇太极、顺治三朝中的经历，然后着重回顾康熙朝的经历，表达了对孙儿康熙及太平盛世的欣慰之情。最后提出，要皇帝勉自节哀，中外文武群臣恪尽职守，共承无疆之福。
这位为大清江山效力近半个世纪的一代女政治家，就这样走完了她的一生。就连她最后的遗嘱，也体现了她的一贯作风：凡事均为大清社稷着想。